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08/14
2021
觀點
通用型CAR-T療法漫談

由CAR-T為代表的免疫細胞療法,為人類抗腫瘤藥物事業添了濃墨重彩的一筆。但不得不説的是,免疫細胞療法的可及性看起來並不高,諾華的Kymriah定價47.5萬美元,吉利德kite的Yescarta定價37.3萬美元,國內復星凱特的阿基倫賽注射液定價也高達120萬人民幣。時至今日,CAR-T療法這隻王謝堂前燕,看起來仍然很難飛入尋常百姓家。上述CAR-T細胞療法的高昂定價,源於其不得不採用“私人訂製”的方式來製備藥物。於是不少研發者開始將目光轉向通用型的細胞療法,通過大規模製備的方式,使得成本大幅降低,從而降低用藥價格。


通用型,off the shelf,是細胞療法領域中被大家提及最多的關鍵詞,指的是同種異體細胞療法,即無需從患者自身體內分離免疫細胞,而是利用異體的免疫細胞,通過一定的改造及培養,再回輸到患者體內(這裏的通用型僅討論通用型“T”,其他通用型“CAR”概念,比如亮氨酸適配體拉鍊CAR,與生物素結合免疫受體CAR,不在此討論)。這一系列流程中技術玄機不少,在搞清楚前,讓我們先來看看為什麼普通的CAR-T細胞療法必須要採用自體的方式。


若異體CAR-T細胞直接輸入到患者體內會發生兩個事件,(1)患者機體本身的免疫系統將異體CAR-T細胞識別為外來物,消滅異體的CAR-T細胞,也就是排異反應(也稱宿主抗移植物反應,HVGR);(2)異體的CAR-T細胞將整個患者視為“非我”,從而瘋狂攻擊患者的各個組織器官,也就是移植物抗宿主病(GvHD)。前者會使得CAR-T藥物失去治療效果,後者則有可能危及患者生命。那麼為什麼會發生上述兩個事件呢,這與細胞的識別機制相關。脊椎動物基因組中有一類家族為主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,MHC),在人類中MHC又稱人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)。編碼HLA的基因位於第6號染色體,分為三大類基因區,其轉錄翻譯而成的蛋白質就是位於細胞表面的HLA抗原,HLA抗原是免疫細胞識別“自我”與“非我”的重要標誌。所以説當進入人體的T細胞表面HLA配型和患者的免疫細胞表面HLA配型不一致時,就會發生上述的HVGR和GvHD。那麼或許就有熱心的朋友問了,HLA的基因座看起來並沒有那麼多,這世界上的人是否就可以分為多個羣體,每個羣體中的人HLA配型都一樣,那麼互相之間就可以異體T細胞回輸了?想法很好,可是現實並非如此,事實上除了同卵雙胞胎之外,世界上很難出現HLA完全相同的兩個人。因為HLA複合體是人體基因多態性最豐富的系統,僅HLA-A這一個位點就有2000+種基因數,各個位點排列組合下來就是天文數字,這點在器官移植配型上體現的淋漓盡致。




大丈夫能屈能伸,既然正面剛不過,那就曲線救國,於是UCAR-T便應運而生。UCAR-T全稱為Universal CAR-T,即通用型CAR-T。UCAR-T本質上是一種同種異體CAR-T細胞療法,無需從患者體內分離T細胞,而是利用健康志願者捐獻T細胞,通過基因編輯技術,讓其能夠避免HVGR,同時避免GvHD,這當中十八般武藝各不相同,讓我們一一瞭解。


解決GvHD


避免GvHD,其重要性不言而喻,其發生會對患者的組織器官造成強烈攻擊,用藥無效不要緊,倘若對患者會造成巨大損傷那就萬分兇險了。因此研究者們首先想要解決的就是GvHD的問題。GvHD觸發事件就是回輸的T細胞表面TCR識別並結合了宿主器官細胞表面的HLA分子,並且這個回輸T細胞發現,二者並不“契合”,於是開始發動攻擊,造成GvHD。相對來説,解決GvHD並不難,目前有幾種技術流派:


1 直接把TCR敲掉


克服GvHD最簡單的方法,只要把回輸T細胞的DNA中,表達TCR受體的基因敲除掉就可以。具體來説主要就是敲除TCRα亞基或β亞基的表達基因,實現手段就是幾種常用的基因編輯方式,如ZFN、TALEN和CRISPR等。目前主流的UCAR-T都會做敲除TCR,當然也有一些該方法的變種,比如Celyad公司靶向NKG2DL的UCAR-T產品CYAD-101,並沒有敲除TCR,而是在CAR之外,還轉了表達TCR抑制性分子(TCR Inhibitory Molecule, TIM)進去,TIM的表達通過干擾CD3ζ的表達來減少TCR的形成,從而抑制了TCR的識別作用,這和敲除TCR有異曲同工之妙。當然,這裏面的CAR設計也需要稍有不同,胞內信號區不能再使用CD3ζ了,而是需要改為使用CD3γ和CD3ε。CYAD-101的適應症是復發/難治性轉移性結直腸癌,目前處於臨牀1期,預計今年下半年會報道臨牀數據。



圖片來源:Celyad公司官網


2 用其他細胞類型來代替


這裏的“其他細胞類型”,主要有NK細胞與γδT細胞。先説NK細胞,NK細胞(natural killer cell)也叫自然殺傷細胞,能通過(a)釋放穿孔素、顆粒酶,(b)表達CD95配體和TRAIL從而誘導靶細胞凋亡,(c)細胞因子介導殺傷,(d)ADCC等方式直接殺死目標細胞。為什麼它能避免GvHD,就是因為NK細胞表面是不表達或極低表達TCR的(NKT細胞除外),它對細胞的殺傷不依賴於TCR,不會引起GvHD,是通用細胞療法的好幫手,現在也有不少公司在做CAR-NK,並且取得一定成績,但CAR-NK仍然存在諸多問題,比如有效性不夠持久,CAR的設計更加困難,CMC較難等,這裏不再贅述。除了NK細胞之外,γδT細胞也逐漸走上舞台。γδT細胞也是T細胞的亞型,其主要作用就是細胞毒性殺傷。γδT細胞並非不表達TCR,而是其表達的TCR不像常規T細胞一樣由αβ亞基組成,而是由γδ亞基組成。γδT細胞本身就具有殺傷腫瘤作用,但是其對腫瘤細胞的識別並不依賴於TCR與MHC-1的結合(這也是為什麼γδT細胞能用來避免GvHD),而是依賴於其細胞表面的獨特受體NCR與腫瘤細胞表面的壓力配體結合。現如今有不少公司在開發基於γδT細胞的腫瘤免疫療法,包括直接用CAR-γδT,或開發相應雙抗等等。此外還有Atara公司做的EBV T細胞,能用來治療EBV相關疾病(安上CAR之後亦可擴發適應症範圍)。但上述不敲TCR的方法,並未完全解決GvHD。關於NK、γδT、EBV T等細胞療法,有興趣的看官也可關注後續系列文章。


解決HVGR

解決了GvHD之後,下一個難啃的硬骨頭就是HVGR了,這也是各個UCAR-T公司真正凸顯實力的時候。HVGR就是患者的免疫細胞對輸入體內的細胞發動攻擊,這裏面主要的“攻擊者”有兩類,即患者的T細胞,與患者的NK細胞。患者T細胞上的TCR識別並結合了回輸T細胞表面的HLA,並且發現二者不“契合”,於是發動攻擊。那麼又有熱心的朋友想問了,我把回輸T細胞表面的HLA全部敲除行不行?答案是否定的,因為還有NK細胞的存在。NK細胞是體內的重要殺傷細胞,是沒有特異選擇性的,NK可以理解為一個“佩刀武士”,並且這名佩刀武士是“見人就砍,毫不留情”,能讓他區分敵人友軍的方式,就是目標細胞表面有沒有表達一些抑制性分子(比如HLA-1類分子),如果一個細胞上有表達HLA-1類分子,那就會被NK識別為友軍不予殺傷;倘若一個細胞上不表達HLA-1類分子,那就會被NK識別為敵人,進行殺傷(NK細胞的這一作用機制若要深究的話,是因為其表面會表達一些抑制性受體,而HLA-1類分子就是這些受體的配體,若二者結合則相安無事,否則就會觸發NK細胞的missing self假説,產生殺傷)。因此,想通過敲除回輸T細胞表面的HLA是行不通的(CD8+T細胞主要表達HLA-1類分子,較少表達HLA-2類分子)。回輸的異體T細胞,不敲HLA是死路一條,敲了HLA還是死路一條,可謂困難重重,所以説解決HVGR就是UCAR-T公司的核心能力所在,目前也已經衍生出多種流派:


1 只敲TCR,不敲HLA,但配合清淋


圖片來源:Cellectis公司官網


清淋就是化療清除淋巴細胞,在自體CAR-T治療之前常需要清淋,即在回輸前5-10天開始給予患者一定劑量的氟達拉濱和環磷酰胺,回輸前1-2天結束。目的是降低腫瘤負荷,並且給CAR-T細胞更多的增殖空間。UCAR-T的第一種技術路徑也一定要伴隨着清淋,因為這類UCAR-T並沒有敲除HLA,因此必須先將人體的淋巴細胞壓制在較低水平一段時間,在這段時間內患者的淋巴細胞較少,不足以對回輸的異源T細胞產生足夠強度的排異反應,故而回輸的UCAR-T方能夠得到擴增時機,並且在這段時間內發揮藥效。這裏就不得不提該領域的重要先驅法國Cellectis(NASDAQ:CLLS),公司的多款UCAR-T都採用TALEN基因編輯的方式,敲除TCRα的方式來克服GvHD,此外並沒有敲除HLA,而是敲除了CD52,在回輸之前的清淋採用氟達拉濱+環磷酰胺+阿倫珠單抗的化療組合。其原因為:氟達拉濱+環磷酰胺這一普通清淋方式,所能維持的這段低淋巴細胞時期較短,大約1-2周左右,在這段時間內異源T細胞能夠獲得增殖機會,可一旦這一時間窗口過去,宿主免疫能力回升,則異源的UCAR-T細胞由於機體排異反應開始死亡,目前主流CAR-T在體內存活的中位數大概為3-4周。Cellectis希望延長這段低淋巴細胞時間窗口,從而讓UCAR-T能在更長的時間內發揮療效,因此給與靶向CD52的阿倫珠單抗,而CD52廣泛表達於各種免疫細胞表面,阿倫珠單抗能夠通過ADCC的方式殺死這些免疫細胞,也就是進一步加深了清淋的效果,使得UCAR-T的可作用時間窗口進一步延長。而敲掉回輸T細胞上的CD52,就是避免阿倫珠單抗殺死回輸的T細胞。在2015年,Cellectis的UCAR-T成功挽救了一名1歲大的AML嬰兒患者,風光一時無兩。不過Cellectis在2017年時由於UCART123導致一例患者死亡而被叫停,並於數月後修改臨牀方案後重新啓動研究。2020年7月Cellectis的UCARCS1A又因為一名患者死亡而被叫停,這也一度使市場對UCAR-T賽道失去信心。Cellectis相關患者死亡案例的原因有多種猜測,可能是因為回輸劑量過高,也有可能是製備的UCAR-T的脱靶率較高。當然這並非説明該技術路徑走不通,國內外亦有部分企業採取該種技術路徑,並做了系統性優化,仍然值得期待。這種路子説白了就是免疫抑制,所以需要引起注意的是,清淋壓制了免疫系統之後對容易引起患者感染的風險。



2 敲TCR,同時敲B2M


HLA-1類分子的結構大致由兩部分組成,即α鏈(由α1、2、3組成)和β鏈,β鏈是非MHC分子β2微球蛋白(B2M),其編碼基因位於人體15號染色體上。HLA-1類分子的形成依賴由α鏈和β鍊形成異源二聚體,當敲除B2M對應的基因後,B2M無法轉錄翻譯出來,α鏈也就無法和β鍊形成二聚,因此細胞膜上α鏈也沒法單獨穩定存在,這就意味着細胞膜上不會存在HLA-1類分子,即:敲了B2M就意味着敲了整個HLA-1。瑞士公司CRISPR Therapeutics(NASDAQ:CRSP)就是採用了這樣的技術路徑,通過CRISPR同時敲除TCR和B2M。敲了B2M可以完美逃過宿主T細胞的攻擊,但是如前所述,缺乏HLA-1的細胞會被NK細胞識別並殺死,所以若要取得良好的效果,則需要在清淋上下更多的功夫。CRISPR設計了獨特的清淋方案,也取得了不錯的臨牀效果,但依然要警惕可能帶來的感染風險。


圖片來源:CRISPR Therapeutics公司招股書


3 敲TCR,敲HLA-1,同時轉入抑制性基因


隨着越來越多HLA-1敲除的產品得到研發,缺失HLA-1分子的UCAR-T細胞容易被NK細胞殺死這件事,得到了更加充分的認知。看NK的名字就知道它是個狠人,這個“佩刀武士” 砍起人來,連它自己都怕,於是不少研發者將目光聚焦於再轉一個抑制性基因進UCAR-T細胞,從而表達出抑制性的配體分子,讓回輸的UCAR-T被NK識別為“友軍”,從而避免被NK細胞殺死。那麼轉什麼樣的抑制性基因合適呢?這裏就需要先研究一下NK細胞表面的受體類型了,NK細胞表面的受體大致可分為兩類,一類是激動性受體(NK細胞的油門),一類是抑制性受體(NK細胞的剎車),因此理論上講,只要給UCAR-T細胞基因組裏導入抑制性受體的配體,就能夠避免被NK細胞殺死。比如非經典的HLA分子,起到替代HLA-1的作用,這裏常用的有導入HLA-E(與NKG2A/CD94複合物結合)、HLA-G(與KIR2DL4結合)、siglect 7、siglect 9等。但是這種方式仍然存在侷限性,比如最常導入的HLA-E的策略,這種方式只能夠阻止NK細胞的亞羣---NKG2A陽性NK的攻擊,但是對其他NK亞羣(例如KIR2DL1-4陽性的NK細胞)的攻擊就不能阻止了,因為KIR2DL1-4陽性NK細胞需要通過HLA-C或HLA-G才能阻止。


圖片來源:Cell Death & Differentiation volume 21, pages5–14 (2014)


4 敲TCR,同時把防禦機制工程化到T細胞上


圖片來源:Nature Biotechnology volume 39, pages 56–63 (2021)


圖片來源:亙喜公司官網


這種流派發現及應用時間尚短,但機制非常新穎有趣,未來潛力不小。比如有一種方式是將免疫防禦受體(alloimmune defense receptor, ADR)工程化到T細胞上去。活化的淋巴細胞,包括T細胞與NK細胞表面,會高表達4-1BB(CD137),而當這些淋巴細胞不再活化時,4-1BB又再次下調,也就是4-1BB是區分活化/非活化淋巴細胞的重要標誌物,而HAGV就是由活化的淋巴細胞攻擊回輸的異體細胞造成,所以説,如果能夠除去這些活化的淋巴細胞,就能避免HAGV。所以這種流派的做法就是轉進入CAR的同時,還轉了一個ADR進去,當然,若想成功應用,TCR還是需要敲的。這個ADR説白了其實就類似一代的CAR,只不過把scFv部分換成了4-1BB的配體,也就是説ADR使得T細胞能直接靶向高表達4-1BB的活化T/NK細胞,進而殺死這些活化的T/NK細胞。此外還有亙喜的TruUCAR平台也是在做相似的事,他們設計的CAR具有雙特異性。其中一種CAR是用於防禦宿主免疫細胞的殺傷的,也就是靶向並殺死宿主的激活T細胞核NK細胞。另一種CAR則用來靶向並殺死腫瘤細胞。其實他們做的事,就是用回輸T細胞本身進行“另一種清淋”,而不是用化療藥物來清淋。這麼做的好處就是清淋效果持久,選擇性更好(只殺死活化的淋巴細胞)。但也有風險存在,就是清淋效果太久,只要回輸的T細胞不死,那麼機體就要長期處於免疫抑制的狀態,這或許為腫瘤患者會帶來風險。


5 敲TCR,同時敲除部分HLA-1分子


在介紹這種流派之前,我們先來講一下器官移植。在組織器官移植配型當中,供體與受體的配型是不需要完全一模一樣的(否則世界上可能就沒多少人能配型成功)。在HLA配型報告中,會重點關注HLA-A、HLA-B、HLA-DR三個基因座的6個位點,並且這6個位點儘量多配,但不強求。這是因為並非所有的HLA分子,都對免疫排斥反應同等重要。在諸多HLA-1類分子當中,其中HLA-A是對免疫排斥最重要的標誌物,也就是説宿主與供體的HLA-A倘若錯配,發生HVGR的風險極大,倘若宿主與供體的HLA-A相合,就只有很小的機率發生HVGR。説回這種UCAR-T的流派,就是利用了HLA-A的重要性。具體方式是敲除細胞TCR的同時,選擇性敲除HLA-A,而非敲掉整個HLA-1類分子。這種方式的好處是,保留其餘HLA-B和HLA-C,此時宿主的NK和T細胞不會殺傷回輸的細胞。並且HLA-B和HLA-C的錯配,反而能夠改善腫瘤患者的復發情況和總生存期,是種一舉兩得的策略。


UCAR-T具有太多的優勢,(1)健康供體效果更好。很多腫瘤患者在給與細胞療法的時候,患者T細胞已暴露在多次放化療、癌症的免疫效應或其他潛在自身免疫疾病中,自體的T細胞大都已發生耗竭。此時再從外周血中提T細胞予以改造,得到的“士兵”也往往戰鬥力不足。尤其是面臨實體瘤這一巨大難關時,倘若自體的CAR-T細胞戰鬥力不足,則更加難以發揮作用。UCAR-T細胞取材自健康供體的T細胞,此時T細胞改造得到的“士兵”能力也更強,更能在實體瘤中發揮療效;(2)現貨供應及時治療。自體CAR-T製備週期長達2-3周,延誤病人獲得治療的時間,而UCAR-T作為現貨型療法,能夠在第一時間給與患者用藥;(3)價格便宜人人可用。自體CAR-T的昂貴价格,如果沒有醫保支持,很多患者會難以負擔。倘若有一款優質的UCAR-T產品成功上市,其價格有可能會低於5萬元人民幣,這將使得細胞治療的滲透率極大提升,惠及更多的患者;(4)批量生產穩定可控。不過UCART雖有千般好,但是想成功採摘這朵懸崖峭壁上的“天山雪蓮”,還需完美跨過GvHD和HVGR兩大難關。目前UCAR-T領域各種武功百花齊放,希望能儘早取得成功,真正改寫細胞療法的歷史,真正造福全世界的廣大患者。